Доклады МОИП. Секция Геронтологии. Том 67

В. Б. Мамаев

Институт биохимической физики РАН им. акад. Н. М. Эмануэля

Показана история развития геронтологии в России на примере Института биохимической физика РАН им. акад. Н. М. Эммануэля: теоретические и экспериментальные разработки по биохимии и биофизической химии старения, начатые академиком Н. М. Эммануэлем, преимущественно в области свободно-радикальной теории старения и влияния антиоксидантов на процессы старения и продолжительность жизни экспериментальных животных.

Ключевые слова: старение, история старения, теории старения.

Начало Начал.

Издавна люди мечтали продлить молодую жизнь. Но переход от мечтаний к реализации произошел только в начале ΧΧ века, когда И. И. Мечников предложил научный подход к лечению преждевременного старения [65]. Он впервые предложил называть эту научную деятельность «геронтологией». Попытки обойтись без научного фундамента при решении этой проблемы кончались или неудачей, или трагедией. Последнее обстоятельство значительно тормозило исследования старения. Для научного решения проблемы старения необходимо было решить сразу, как минимум, две задачи:

– найти метод замедления скорости старения, соответствующий предлагаемым теоретическим предположениям,

– количественно оценить величину положительного эффекта.

Важно подчеркнуть, что в те времена, и даже в настоящее время, единодушного метода определения/измерения старения не было. Кроме того не было ВАКовской специальности «геронтология», как и научного журнала по геронтологии, а также геронтологической лаборатории в АН СССР. «Медицинский институт был, а науки (в понимании сотрудников АН СССР) не было».

Несмотря на эти сложности и негативное отношение научной общественности Академии Наук СССР к геронтологии, в середине 60-х годов прошлого столетия основатель Института биохимической физики РАН академик Н. М. Эмануэль начал научные геронтологические работы в рамках своего отдела «Кинетики химических и биологических процессов» Института химической физики АН СССР.

Очевидно, первый шаг в сторону геронтологии Николай Маркович сделал значительно раньше, в 1940 году, когда стал изучать «медленный вырожденный взрыв» при горении сероводорода в кислороде.

Он показал, что, как и при быстрых реакциях горения, медленные реакции горения протекают через промежуточные вещества свободно-радикальной природы (моно оксид серы) [9, 10] и именно это промежуточное вещество играет решающую роль в механизме цепного окисления.

Важным этапом в исследованиях была идея Н.М. относительно новых принципов управления сложными стадийными процессами, при которых условия проведения реакций (в том числе добавки ингибиторов) не задаются раз и навсегда в начальный момент, а рационально изменяются по ходу процесса [11]. В короткий срок была создана и экспериментально обоснована цепная теория жидкофазного окисления органических веществ.

В дальнейшем проблема торможения и подавления нежелательных окислительно-деструктивных процессов становится одной из основных в экспериментальных и теоретических исследованиях Н.М.

Эмануэлем и сотрудниками было открыто явление избирательного ингибирования многоцентровых цепных процессов некоторыми ингибиторами (например, нитроксильными радикалами), взаимодействующими с одним из активных центров цепной реакции и не влияющими на развитие основной цепи окисления. Выполнен теоретический анализ явления и раскрыт его механизм.

Большой научный и практический интерес представляет исследование явления синергизма в смесях ингибиторов. В работах Николая Марковича и сотрудников было установлено неизвестное ранее явление радикального взаимодействия ингибиторов в процессах окисления органических веществ, заключающееся в регенерации более эффективного ингибитора вследствие переноса атома водорода к его радикалу от молекулы менее эффективного ингибитора и лежащее в основе усиления суммарного тормозящего действия ингибиторов при стабилизации органических материалов смесями ингибиторов.

Очень важным этапом было исследование механизмов лучевого поражения и применение синтетических ингибиторов радикальных процессов. Н. М. Эмануэлем с сотрудниками установлена природа первичных свободно-радикальных молекулярных нарушений, возникающих в тканях животных под действием гамма-радиации, различия в поражении ДНК и мембран в тканях с разной радиочувствительностью. Исследован молекулярный механизм пост-радиационных изменений в биоэнергетике и биосинтетических процессах в тканях органов животных в ходе лучевой болезни.

При бурном обсуждении этих принципиально новых биохимических механизмов родилось понятие «антиоксидант». (Антиоксидант – это вещество, обладающее свойствами ингибитора свободно-радикальных реакций и уравновешивающее взрывной характер цепных свободно-радикальных реакций в организме.)

Убедительно показана на молекулярном, клеточном и организменном уровне возможность торможения развития лучевых повреждений с помощью малотоксичных ингибиторов свободно-радикальных реакций – антиоксидантов. Они проявляют защитное действие в случае лучевой болезни и болезни, вызванной введением радио-миметиков. Установлена важная роль природных биоантиоксидантов, содержащихся в мембранах клеток.

Широкий спектр и особенности биологического действия ингибиторов радикальных процессов сделали необходимым выяснения молекулярных механизмов их действия.

Молекулярные механизмы действия ингибиторов обусловлены особенностями их химического строения, и в первую очередь наличием окси- или амино-ароматической группировки. Так, для соединений фенольного ряда характерна способность к различным реакциям с отрывом атома водорода от гидроксильной группы и промежуточным образованием свободных радикалов. Кинетические исследования реакций с участием ферментов гликолиза или РНК-полимеразы позволили установить, что их торможение обусловлено свободно-радикальными продуктами авто-окисления ингибиторов. Такие продукты окисляют SH-группы ферментов с образованием дисульфидных связей, ингибируя их активность.

Исследование старения экспериментальных животных

Изучение свойств антиоксидантов-радиопротекторов позволили плавно перейти к замедлению старения организма и исследованию механизмов. В 1968 году, комментируя статью в газете «Санди Таймс» об опытах Хармана, лежащих точно в той же научной области, Н. М. писал: «Результаты, полученные доктором Харманом, следует рассматривать как вполне достоверные. При этом следует отметить, что использование для подавления вышеупомянутых патологических процессов вещества, способные „захватывать“ свободные радикалы (так называемые ингибиторы радикальных процессов), было сделано впервые советскими учеными. Однако, по нашему мнению, в дальнейшем в биологии и в медицине целесообразно применять не ионол как таковой, а различные, разумно синтезированные малотоксичные Ингибиторы Радикальных Процессов» [18].

Существенной проверкой правильности новых выбранных направлений исследования старения были выступления на ΙΧ Международном конгрессе геронтологов в 1972 году в Киеве [19, 55]. Уместно заметить, что к этому времени уже были опубликованы как статьи Хармана [84], где было показано увеличение только средней продолжительности мышей на 44,6%, так и его критиков [92]. Хармана на конгрессе не было, но вопросы к его работе витали в воздухе. Может быть, поэтому пристальное внимание на конгрессе привлек доклад Н. М. Эмануэля [19] по замедлению старения мышей антиоксидантами. Увеличение средней продолжительности жизни на 25,3% и максимальной продолжительности жизни на 55,8%, полученные в ИХФ АН СССР [41] на основе хорошо обоснованного экспериментально-теоретического фундамента, в тот момент склонили чашу весов в пользу свободно-радикальной теории.

Кинетические закономерности выживаемости и определение скорости старения в эксперименте

Под процессом старения организма, в том числе и человека, мы [50] понимаем биологический процесс, который проявляется (а мы его измеряем) на популяционном уровне. Это – универсальный, эндогенный, разрушительный биологический процесс, который приводит к увеличению вероятности смерти с возрастом. Если начало старения (увеличения вероятности смерти с возрастом) приходится на возрастной интервал 10—15 лет, то конец в возрастной группе 95+. Это означает, что процесс старения включает большую часть жизненного пути организма. Т.е. процесс старения включает: начало старения (эндогенные причины старения); возрастные патогенные процессы (предболезнь); саногенные (защитные) процессы; возрастное разрушение организма, сопровождаемое патологическими процессами (т.е. возрастными болезнями); полное уничтожение данной когорты ровесников. В литературе часто понятие старения трактуют более узко, причем каждый на свой лад. Одни старение воспринимают, как предболезнь (патогенный процесс).

Т.е. естественные возрастные изменения организма, которые приводят или сопровождают развитие болезни. Другие наоборот считают старение последним этапом жизни, когда организм превращается в дряхлое создание перед концом жизни. Определение старения, которое обосновал Б. Стрелер в 1960 году [101] (в русском переводе в 1964 году [73]), не противоречит здравому смыслу и, самое главное, дает геронтологам количественный измеритель старения (возрастное увеличение вероятности смерти, т.е. возрастную смертность).

В те времена (60 – 70-ые годы) даже в киевском институте геронтологии никто не строил кривые смертности (ни мышей, ни людей). Они изучали возрастные физиологические механизмы старения, не измеряя старение. Тогда как, для количественной оценки скорости старения мышей обычно анализировали картину смертности популяции. Так как средняя продолжительность жизни существенно зависит от факторов окружающей среды и питания, то это приводило к значительной разнице показателей выживаемости, получаемых в разных лабораториях для животных одних и тех же инбредных линий.

Для отработки метода измерения скорости старения были изучены кинетические закономерности выживаемости линейных мышей CBA, C3HA, (C57BLCBA) F1 гибридов первого поколения и (SHK) нелинейных лабораторных мышей [61]. Опыты проводились с животными 2-месячного возраста (самки), полученными из Центрального питомника лабораторных животных МЗ СССР отделения «Крюково». Мыши SHK в возрасте 7,5—8 месяцев были взяты из того же источника. Условия содержания животных соответствовали требованиям, предъявляемым к длительным экспериментам на выживаемость.

Важнейшей характеристикой всякого процесса, протекающего во времени, является его скорость. Для измерения скорости старения в экспериментальной геронтологии нет единого принятого метода, большинство исследователей пользуются для этих целей статистическими показателями, такими, как средняя и максимальная продолжительность жизни, средняя продолжительность предстоящей жизни и выживаемость. Кривые выживаемости дают наглядное представление об изменении численности популяции, но благодаря их сложности (S-образные кривые, рис.1) определение скорости смертности, величина которой меняется с возрастом, требует дополнительной математической обработки. Обработка кривых подобного типа заключается в подборе эмпирических зависимостей вида: x = A / (a + e a +b t) («логистические» или «автокаталитические» функции). Применение для обработки этих данных «пробит» метод позволяет представить кривую выживаемости в виде прямой, отсекающей на оси времени отрезок, равный возрасту при 50%-ной смертности («медиана»); из наклона прямой может быть определена средняя скорость смертности в %, т.е. этот метод позволяет определить величины, имеющие вполне определенный биологический смысл [74].

Рис. 1. Кривые выживаемости мышей [26]: 1 – SHK нелинейных лабораторных мышей, 2 – CBA, 3 – C3HA, 4 – (C57BLCBA) F1 гибридов первого поколения.

На рис. 2 представлено такое преобразование кривых выживаемости. При вычислении скорости смертности следует принимать во внимание неравномерность шкалы «пробит», благодаря чему сравнимые данные могут быть получены только с определенных участков прямой.

Рис.2. Пробит-трансформация кривых выживаемости мышей.

1 – SHK нелинейных лабораторных мышей, 2 – CBA, 3 – C3HA, 4 – (C57BLCBA) F1 гибридов первого поколения.

Если, как в случае прямых, изображенных на рис. 2, линейная аппроксимация удовлетворительна в интервале от 10 до 90% смертности, то можно использовать весь этот участок и вычислить среднюю скорость смертности (таблица 1), которая составляет для мышей SHK нелинейных лабораторных мышей = 6,2% в месяц; CBA = 6,2% в месяц; C3HA = 4,7% в месяц, (C57BLCBA) F1 гибридов первого поколения = 5,3% в месяц.

Известно, что гибриды первого поколения обычно жизнеспособнее животных родительских линий. Это наблюдение подтвердилось и в данной работе. Величины показателей выживаемости (C57BLCBA) F1 близки к данным, опубликованным Смитом и соавторами [99]. Величины средней продолжительности жизни мышей CBA, определенные другими авторами, значительно различаются: 27, 2; 17,5; 21,2 месяца [20, 102, 99]. Преимущества этого способа обработки экспериментальных данных особенно наглядны в тех случаях, когда посредством какого-либо воздействия (облучение, голодание, стресс, применение геропротекторов и т.п.) в ходе опыта изменяется скорость старения.

Таблица 1. Продолжительность жизни мышей разных линий.

Таким образом, использование геропротектора (хлоргидрат 2-этил-6 метил-3-оксипиридин) приводит к замедлению процесса старения у мышей SHK в среднем в 1,8 раза (таблица 3 и рис. 3).

Таблица 2. Влияние геропротектора на смертность мышей.

Экспериментальные данные о влиянии антиоксидантов на выживание экспериментальных животных нашли соответствующее отражение в литературе и, естественно, вызвали большое количество вопросов. Уместно остановиться на некоторых из них.

1-ый вопрос. Достоверен ли пролонгирующий эффект антиоксидантов?

Ответ. Известно, что при достаточной выборке (более 40 линейных мышей в группе) средняя продолжительность жизни (СПЖ) воспроизводится с точностью 3—4%, тогда как пролонгирующий эффект достигал 33%. Т.е. в этих случаях увеличение продолжительности жизни при действии антиоксиданта статистически достоверно и значимо. Для человека 30%-ое увеличение продолжительности жизни означало бы дополнительные 20 лет жизни.

Рис.3. Влияние хлоргидрата 2-этил-6 метил-3-оксипиридина на выживаемость мышей SHK. А – Кривые выживаемости: 1 – контроль, 2 – опыт; Б – пробит-трансформация кривых выживаемости.

2-ой вопрос. Действует ли антиоксиданты только на короткоживущих (мутантных) мышей, предрасположенных к опухолям?

Ответ. Как видно, эмоксипин увеличивал среднюю (СПЖ) и максимальную продолжительность жизни (МПЖ) не только короткоживущих мышей (SHK), но и долгоживущих мышей (С3НА).

Т. е. СПЖ и МПЖ мышей SHK в контрольной группе были равны 15 и 19 месяцев, под воздействием антиоксиданта увеличились до 19 и 30 месяцев соответственно. Для мышей линии С3НА в контрольной группе СПЖ и МПЖ были равны 22 и 32 месяца, а под влиянием эмоксипина достигли 27 и 41 месяца. Тогда как, на высокораковую линию мышей AKR эта же доза эмоксипина на оказала никакого влияния.

Таблица 3. Влияние антиоксидантов на продолжительность жизни экспериментальных животных.

3-й вопрос. Прямо или опосредованно действуют антиоксиданты?

«В эксперименте с ионолом параллельно увеличению средней продолжительности жизни снижалась масса тела мышей. Однако остается неясным, обусловлено ли специфическое действие антиоксидантов на длительность жизни непосредственно ослаблением свободнорадикальных реакций в тканях или оно опосредовано замедлением индивидуального развития на стадии роста у млекопитающих». Ответ. При анализе результатов экспериментов с ионолом видно, что различия веса подопытных и контрольных минимальны. Так по данным Хармана, средняя масса тела мышей контрольной группы составляла 31,6 г, а у подопытных, когда СПЖ увеличилась на 45%, масса тела была 29,2 г. Тогда как при сдерживающей рост диете масса тела контрольных животных была в 1,5 – 2 раза больше массы тела подопытных мышей.

К тому же, как потом оказалось, антиоксиданты сами по себе поливалентны и могут влиять одновременно на многие геронтологические процессы (более четырех механизмов или моделей старения).

На рисунке 4 показаны различные варианты воздействия антиоксидантов на кривые выживания:

Рис.4. Типы изменения кривых выживаемости при действии геропротекторов.

I – Равномерное замедление старения: равное увеличение средней и максимальной

продолжительности жизни (ПЖ).

II – Замедление старение с большой лаг-фазой: большее увеличение максимальной ПЖ.

III – Улучшение условий жизни: увеличение только средней ПЖ, а не максимальной ПЖ.

Вещества, которые замедляли старение (I и II вариант), стали называть геропротекторами.

Необходимым условием доказательства, что данное препарат действительно геропротектор, стало достоверное уменьшение смертности под его влиянием во всех возрастных группах экспериментальных животных. При этом условии не возникает вопрос о продлении жизни одних особей популяции за счёт укорочении жизни других. Особое значение приобрели работы, в которых установлен не только факт увеличения средней продолжительности жизни (СПЖ), но и максимальной продолжительности жизни (МПЖ). Изменение только СПЖ может быть связано не с процессом старения экспериментальных животных, а с изменением условий их жизни. Только после того, как установлен факт увеличения продолжительности жизни экспериментальных животных, серьезное значение приобретает изучение особенностей влияния этого вещества на отдельные системы организма. Легкость, с которой открывали все новые антиоксиданты-геропротекторы и свободно-радикальные патологии, создала бум вокруг антиоксидантов-геропротекторов.

Работы Хармана были процитированы более 5500 раз. В результате были поставлены проверочные, хорошо обставленные исследования на большой выборке (до 250 000 человек), которые показали, что антиоксидантные витамины в некоторых комбинациях не оказывают ожидаемого положительного влияния на продолжительность жизни человека, а в отдельных вариантах оказывают отрицательное действие. До сих пор эти работы широко цитируются в научной и популярной геронтологической литературе, хотя были опубликованы многочисленные разъяснения этих отрицательных эффектов антиоксидантных витаминов.

Уместно вспомнить, что научной теории, чтобы развиться, просто необходимы общественные проклятия, ненависть научной среды и осмеяние в прессе. Именно эти факторы обычно мобилизуют и вооружают серьезные идеи, провоцируют их на движение и победы [67]. Очевидно, что эти эксперименты ярко продемонстрировали, что иллюзия легкости обращения со свободно-радикальной тематикой возникла от недостаточности знаний в этой области, что свободно-радикальная теория еще нуждается в доработке и дальнейшем развитии. Т.е. возникла необходимость развития свободно-радикальной теории старения, которую мы решили назвать в новом варианте «антиоксидантная концепция старения». Что с самого начала во главу ставит не повреждение, а защиту от агрессоров. Следует подчеркнуть наиболее важные моменты:

– исправление ошибок интерпретации и логических несоответствий критических нападок противников антиоксидантов;

– связь свободно-радикальных механизмов старения с возрастным увеличением смертности от главных пато-геронтологических процессов (болезней системы кровообращения и злокачественных новообразований);

– стремление к пониманию старения именно человека. Так как механизмы старения человека часто отличаются от механизмов старения мышей и дрозофил.

С целью дальнейшего развития начатых работ в 1975 году на Секции химико-технологических и биологических наук АН СССР была сформирована комиссия по проблемам «Искусственного увеличения видовой продолжительности жизни людей». Председателем комиссии назначен академик Н. М. Эмануэль, его заместителем – Л. В. Комаров. Был составлен координационный план научных исследований по проблеме «Искусственное увеличение видовой продолжительности жизни людей» на 1976—1985 гг.